فرآوری بیولوژیکی برخی از فرآورده های فرعی کشاورزی توسط باکتری ها

فرآوری بیولوژیکی برخی از فرآورده های فرعی کشاورزی توسط باکتری های

 هوازی گرم منفی

محسن برجی

مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان مرکزی

چکیده

این مطالعه به منظور ارزیابی توانایی سه گونه از باکتری های هوازی گرم منفی در بهبود کیفیت مواد لیگنوسلولزی انجام شد. باکتری ها در یک دوره شش هفته ای بر روی کاه جو، کلش گندم و خاک اره رشد داده شدند و تجزیه مواد لیگنوسلولزی با تعیین میزان کاهش وزن، کاهش لیگنین و کربوهیدرات و افزایش پروتئین و قابلیت هضم (in vitro) بررسی شد. باسیلوس اسفریکوس به وضوح نسبت به سایر گونه های ارزیابی شده مؤثرترین گونه بوده که به نحو معنی داری( 05/0 P < ) لیگنین را کاهش داده و پروتئین و قابلیت هضم را افزایش داده است. بهبود ترکیب شیمیایی و ارزش غذایی لیگنوسلولز های غلات نسبت به لیگنوسلولز های چوب بیشتر بود.

لغات کلیدی: فرآوری بیولوژیکی، ضایعات کشاورزی، باکتری ها 

مقدمه

 با توجه به حجم انبوه مواد لیگنوسلولزی تولید شده، اجتناب ناپذیر بودن تولید حداقل بخشی از این مواد (به عنوان فرآورده های فرعی در هنگام تولید محصولات کشاورزی) و تقاضا جهت استفاده از این مواد در تغذیه دام به عنوان یک خوراک ارزان در کشورهای جهان سوم، دامداران سنتی و به خصوص در شرایطی که عرضه علوفه کم است توجه به حل نواقص موجود در مواد لیگنو سلولزی جلب شده است. به منظور حل مهمترین نقص یعنی کمبود ارزش غذایی، اخیرا توجه به کاربرد روش های بیولوژیکی جلب شده است. لیگنین مهمترین عامل کمبود ارزش غذایی است که سعی می شود تا با کاربرد قارچ ها یا باکتری ها این ماده را حذف نموده یا حداقل ارتباط آن با کربوهیدرات های دیواره را قطع نمایند.   مشخص شده که گونه های نوکاردیا قادر به تجزیه لیگنین بودند (Trojanowski et al., 1977) و توانستند هم دی هیدروپلی مرهای نشان دار و هم لیگنین های  نشان دار در لیگنوسلولز های گیاهی را تجزیه کنند (Trojanowski  et al., 1977,  Haider et al., 1978) . یک سوش از باسیلوس مگاتریوم ( Bacillus megaterium ) ، جداسازی شده از مواد گیاهی در حال پوسیدگی نیز به سرعت اجزاء زنجیر جانبی لیگنین های طبیعی در داخل لیگنوسلولز را تجزیه نمود . همچنین این باکتری توانست اجزاء حلقه دی هیدروپلی مرهای نشان دار را به آرامی تجزیه نماید ( Robinson and Crawford 1978) .

طبق نظر ریچارد (Richard, 2000) عواملی از جمله ازت کافی ، رطوبت ، حرارت و ترکیب فیزیکو شیمیایی سوبسترای لیگنوسلولزی در میزان تجزیه لیگنین اهمیت زیادی دارند . لذا هدف از مطالعه حاضر بررسی توان سه گونه باکتریایی در بهبود کیفیت سه نوع ماده لیگنوسلولزی بود.

مواد و روش ها

در مطالعه حاضر از سه گونه باکتریایی که در یک مطالعه دیگر جدا و خالص سازی شده بود ( شامل گونه های باسیلوس اسفریکوس ، آکروباکتریوم آنتروپی و انتروباکترکلو آکا ) به عنوان مواد تلقیحی استفاده شد. به 54 ارلن cc250 ، cc200 محلول M96.2g Na2HPO4 + 3.5g KH2PO4 + 0.5g NaCl + 1.0g  NH4Cl (در هر لیتر) و 5/2 درصد از مواد لیگنوسلولزی (شامل کلش گندم ، کاه جو یا خاک اره) اضافه شد. ارلن ها برای دو ساعت در دمای    Cْ121 استریل شدند. امولسیون هر گونه باکتریایی به میزان 1 میلی لیتر برای تلقیح ارلن ها مورد استفاده قرار گرفت. ارلن ها برای 6 هفته در دمای  C ْ37 اینکوبه شدند.هر هفته تعداد باکتری ها (با شمارش کلنی) ثبت شد.  پروتئین خام، کربوهیدرات، کاهش وزن،و لیگنین محلول و نامحلول با استفاده از روش های موجود تعیین شد(AOAC, 1979; Antai and Crawford, 1981) و کاهش یا افزایش آن با گروه شاهد مقایسه شد. قابلیت هضم آزمایشگاهی نیز با استفاده از روش های موجود تعیین شد.در این آزمایش نوع ماده لیگنوسلولزی ( سه نوع ماده ) و گونه باکتریایی فاکتور های آزمایشی بودند که در سه تکرار با استفاده از یک طرح کاملا تصادفی متعادل و آزمایش فاکتوریل بررسی شدند. 

نتایج و بحث

 تجزیه داده ها نشان داد که بیشترین میزان رشد باکتریایی مربوط به محیط کشت های دارای گونه باسیلوس و کلش گندم و کاه جو بود ( 05/0 P < )(داده ها نشان ارائه نشده اند). از آنجایی که کلیه شرایط محیطی کشت ( از جمله دما ، pH  ، فشار اکسیژن و مدت انکوباسیون) بین هرسه گونه یکسان بوده است ،‌تنها عامل اثر گذار به طور مستقیم گونه باکتریایی و به طور غیر مستقیم توانایی گونه باکتریایی درترشح آنزیم های تجزیه کننده لیگنوسلولز است همچنان که یانگ و همکاران (Yang et al.,1995 ) گزارش نمودند که سویه باسیلوسی تحت مطالعه آنها تولید کننده یکی از فعال ترین زایلا نازهایی است که تاکنون برای باکتری ها وقارچ ها گزارش شده است . نتایج نشان داد که هم استفاده از تلقیح میکروبی و هم نوع ماده لیگنوسلولزی تأثیر بسیار معنی داری بر میزان پروتئین نمونه داشت ( 01/0 P< ) . مقایسه میانگین های گونه های باکتریایی تحت بررسی نشان داد که گونه باسیلوس بیشترین افزایش درصد پروتئین را موجب شد که با گروه شاهد و سایر گروه های باکتریایی دیگر نیز دارای اختلاف معنی دار بود
( 05/0 P< ) . این مسئله نشان دهنده توان استفاده بیشتر باسیلوس از ماده لیگنوسلولزی است .در این مورد مطالعه کراوفورد
( Crawford , 1978 ) نشان داد که رشد سه سوش استرپتومایسزی  ( سوش های 28 ، 87A  و 177 ) در یک دوره    14 روزه بر روی لیگنوسلولزهای صنوبر میزان پروتئین را از 5 تا 12 درصد افزایش داد .بیشترین درصد کاهش کربو هیدرات ها، کاهش وزن (تجزیه ماده خشک) مواد لیگنوسلولزی، تجزیه (کاهش) لیگنین، و بهبود(افزایش) قابلیت هضم در کاه گندم و کاه جو مشاهده شد که هردو با خاک اره دارای اختلاف معنی دار بودند ( 05/0 P < ) . مؤثرترین نمونه های میکروبی تلقیح شده در کاهش کربو هیدرات ها، کاهش وزن (تجزیه ماده خشک) مواد لیگنوسلولزی، تجزیه (کاهش) لیگنین، و بهبود(افزایش) قابلیت هضم ابتدا گونه باسیلوس بود که به دنبال آن گونه آکروباکتریوم ( در سطوح مجزا ) قرارداشت( 05/0 P < ).همچنان که در مطالعه کراوفورد و همکاران (Crawford et al., 1983 ) استرپتومایسز و یریدوسپوروس بعد از 8 هفته موجب کاهش 4/44 درصدی کربو هیدرات لیگنو سلولز ساقه ذرت  شد. یکی از عوامل مهم در تجزیه اجزای دیواره سلولی در مواد لیگنوسلولزی، لیگنین نمونه است. بیشتر بودن میزان تجزیه در گراس ها (کلش گندم و کاه گندم)نسبت به خاک اره می تواند به دلیل بالاتر بودن میزان پروتئین در گراس ها، کم تر بودن میزان لیگنین در گراس ها و کمتر بودن نسبت کربن به ازت باشد.(VanSoest , 1994)همچنان که در مطالعه آنتایی و کراوفورد (Antai amd Crawford , 1981) کاهش وزن لیگنوسلولز گراس ها به وسیله استرپتوماسیزها تقریباً دو برابر چوب نرم ها و چوب سخت ها بوده است.

در یک آزمایش استرپتومایسز ویریدوسپوروس پس از رشد 8 هفته ای بر روی  لیگنوسلولزهای  ذرت موجب کاهش 7/19 درصدی لیگنین شد (Crowford et al., 1983) در حالیکه در مطالعه دیگر (Borgmeyer and Crawford, 1985) این میزان 21% بود. نتایج مربوط به تأثیر انواع مواد لیگنوسلولزی همراه با فرآوری باکتریایی بر میزان تجزیه لیگنین نشان داد که بیشترین میزان تجزیه لیگنین در کاه جو و کلش گندم اتفاق افتاد که هر دو با خاک اره دارای اختلاف معنی دار بودند(05/0 P< ).

در مطالعه آنتایی و کراوفورد (Antai and Crawford, 1981) میزان کاهش لیگنین در چوب نرم ها ، چوب سخت ها  و گراس ها برای استرپتومایسز ویدیدوسپوروس به ترتیب 9/30،0/32و2/44 درصد بود. 

مجموع نتایج آزمایشات نشان داد که گونه باسیلوس و به دنبال آن گونه انتروباکتر افزایش قابلیت هضم لیگنوسلولز را موجب شده اند که همین وضعیت در سطوح پایین تر در گونه انتروباکتر نیز قابل مشاهده بود. در بین مواد لیگنوسلولزی نیز بیشترین قابلیت هضم در کاه جو و کاه گندم مشاهده شد که در مقایسه با خاک اره اثرات قابل توجهی را اعمال نمودند.

قابلیت هضم خود تابعی از عوامل فیزیکی و شیمیایی موجود در نمونه از جمله میزان لیگنین ، نوع لیگنین ، ارتباط لیگنین با سایر اجزاء دیواره سلولی ، نسبت لیگنین با سایر ترکیبات موجود در نمونه، ناحیه سطحی موجود در نمونه و بسیاری از عوامل دیگر است. بنابراین می توان انتظار داشت که کاهش لیگنین و یا شکستن اتصالات لیگنین – کربوهیدرات منجر به بهبود قابلیت هضم نمونه شود. چنین روندی در مطالعه حاضر قابل مشاهده بود. به عبارت دیگر قابلیت هضم در محیط کشت هایی که ترکیب لیگنوسلولز موجود در آن تحت تأثیر فرآوری باکتریایی و سایر عوامل بهبود یافته بود، زیادتر شد.

نتیجه گیری

 نتایج این تحقیق نشان داد که برخی از گونه های باکتریایی می توانند به نحو قابل توجه در بهبود کیفیت مواد خشبی مورد استفاده قرار گیرند.

جدول 1- تأثیر فرآوری باکتریایی برکاهش وزن ، تغییر ترکیبات شیمیایی و قابلیت هضم مواد لیگنوسلولزی

قابلیت هضم آزمایشگاهی ماده خشک ( % )	لیگنین نامحلول (% )	لیگنین محلول ( % )	وزن ( gr )	کربوهیدرات ( % )	پروتئین ( % )	تیمـارها
cab77/32	25/12g	99/4def	82/4a	82/56b	21/5de	شاهد،کاه جو
cb34/30	46/10h	39/15ab	46/4bc	18/51c	64/5c	انترو،کاه جو
cab14/36	07/10h	35/20a	27/4cde	12/50cd	64/5c	اکرو،کاه جو
a54/45	05/10h	82/19a	09/4ef	41/46ef	21/6a	باسیلوس،کاه جو
d42/16	71/27a	.05/1f	91/4a	58/59a	53/2i	شاهد، خاک اره
d53/15	69/26b	.05/4ef	65/4ab	81/60a	71/2hi	انترو، خاک اره
d08/16	0/25c	21/10bcd	44/4bcd	26/54b	84/2gh	اکرو،خاک اره
cd88/23	33/22d	06/19a	15/4fe	80/50c	95/2g	باسیلوس،خاک اره
cab26/33	41/15e	28/3ef	91/4a	22/54b	72/4f	شاهد، کاه گندم
cab35/34	44/14ef	46/8cde	37/4cde	60/47ed	02/5e	انترو، کاه گندم
cab45/36	76/13f	26/12bc	17/4def	90/45ef	29/5d	اکرو، کاه گندم
ab77/42	22/12g	79/20a	97/3f	33/44f	87/5b	باسیلوس، کاه گندم

-   میزان پروتئین نمونه اولین کلش گندم 7/4درصد، کاه جو 5 درصدو خاک اره 5/2 درصد بود

-    میزان کربوهیدرات نمونه اولیه کلش گندم 56 درصد ، کاه جو 60 درصد و خاک اره 60 درصد بود.

-   میزان لیگنین نمونه اولیه کلش گندم 16 درصد ، کاه جو 13 درصد و خاک اره 28درصد بود

-   وزن اولیه هریک از مواد لیگنوسلولزی 5 گرم بود .

-   در هر ستون میانگین هایی که دارای حروف غیریکنواخت هستند در سطح 5 درصد دارای اختلاف معنی دار میباشند .

منابع

1.       Antai, S. P., and Crawford, D. L. 1981. Degradation of softwood, hardwood,  and grass lignocelluloses by two Streptomyces strains. Applied and Environmental Microbiology, 42: 378- 380.

2.     AOAC. 1979. Official Methods of Analysis, 12th Ed., PP. 927-928, Association of Analytical Chemists, Washington, D.C.

3.     Bargmeyer, J. R., and Crawford, D. L. 1985. Production and characterization of polymeric lignin degradation intermediates from two different Streptomyces spp. Applied and Environnental Microbiology, 49: 273-278.

4.     Crawford, D. L. 1978. Lignocellulose decomposition by selected Streptomyces strains. Applied and Environmental Microbiolgy, 35: 1041-1045.

5.     Crawford, D. L., Pometto, A. L. and Crawford, R. L. 1983. Lignin degradation by streptomyces viridosporus: Isolation and characterization of a new polymeric lignin degradation intermedia. Applied and Environmental Microbiology, 45: 898-904.

6.     Deobald, L. A., and Crawford, D. L. 1987. Activities of cellulase and other extracellular enzymes during lignin solubilization by Streptomyces viridosporus. Applied Microbiology and Biotechnology, 26:158-163.

7.     Haider, K., Trojanowski, J.,  and  Sundman, V. 1978. Screening for lignin degrading bacteria by means of ¹⁴C  - Labeled lignins. Archae Microbiology, 119: 103-106.

8.     McCarthy, A. J, Paterson, A., and Borda, P. 1986. Lignin solubilization by Thermomonospora mesophial. Applied Microbiology and Biotechnlolgy, 24:347-352.

9.     Richard, T. 2000. The effects of lignin on biodegradability. Cornell Composting. Sciene and Engineering.

10.   Robinson, I. E., and Crawford, R. L. 1978. Degradation of  ¹⁴C – Labeled lignins by Bacillus megaterium. FEMS Microbiology Letters, 4:301-302.

11.  Trojanowski, J., Haider, K., and Sundman, V. 1977. Decomposition of ¹⁴C – Labeled lignin and phenols by a Nocardia sp. Archae Microbiology, 114: 149-153.

12.  Van Soest, P. J. 1994. The Nutritional Ecology of the Ruminant, 2nd edition, Cornell University Press . Ithaca, Ny. PP. 476.

13.  Yang, V. W., Zhuang, Z., Elegir, G., and Jeffries, T. W. 1995. Alkaline- active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp. isolated from kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology, 15: 434-441.

Bio-Processing of Some Agriculture Wastes by Gram- Negative

Aerobic Bacteria

SUMMARY:

This study was conducted to evaluate the ability of three species of gram-negative aerobic bacteria for improvement of lignocelluloses quality. The bacteria were grown on barley straw, wheat stalk and saw dust in a 6-week growth period and lignocellulose decomposition was followed by monitoring substrate weight loss, lignin loss and carbohydrate loss and improvement of protein and digestibility (in vitro) over time. Bacillus sphaericus was clearly the superior and most effective species of those tested that significantly decreased lignin and increased protein and digestibility (P<0.05).  Improvement of chemical composition and nutritive value of grass lignocelluloses was more than wood lignocelluloses.

Key words: Bio-Processing , Agriculture Wastes, Bacteria.